qPCR
        熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出,由于該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規PCR相比,它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點,目前已得到廣泛應用。 熒光定量PCR技術是通過熒光染料或熒光標記的特異性探針,對PCR產物進行標記跟蹤,實時監控反應過程。隨著PCR 反應的進行,反應產物不斷累積,熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環,收集一次熒光強度信號,這樣就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化,結合相應的軟件對產物進行分析,可以得到熒光擴增曲線,計算待測樣品初始模版的量。實時熒光定量PCR技術是一次由定性技術向定量技術的飛躍,運用該項技術,可以對DNA、RNA樣品進行相對定量、絕對定量和定性分析。

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項目類型

檢測方法

熒光定量PCR服務價格

熒光定量
PCR服務

SYBR Green染料法
taqman探針法

位點調試費

RNA提取+逆轉錄

定量pcr三復孔

200元/基因

100元/樣品

100元/基因/樣品


◆ 備注

1、絕對定量,標準曲線另外收取(260元/基因)。

2、探針法,探針需另外收取費用(500元/條,默認FAM、BHQ)。


檢測分類

1. mRNA表達量水平檢測:相對定量法。
2. MicroRNA表達量水平檢測:通過設計特殊莖環結構的反轉錄引物,結合實時定量PCR可以精確檢測微量樣品中microRNA表達水平。內參基因一般用U6。
3. 基因拷貝數檢測:如檢測樣品中不同細菌含量、基因工程菌目的基因拷貝數、環境中耐藥基因檢測等。采用絕對定量法。

定量方式

1. 絕對定量:用已知濃度的標準品繪制標準曲線,而后通過標準曲線對未知濃度的檢測樣品進行絕對量(起始拷貝數)分析。
2. 相對定量:以內參基因為參照,比較兩個或兩個以上樣本中某個基因表達量的變化,通常用來對mRNA表達量進行分析。一般采用2-ΔΔ Ct 法進行計算。每個樣本重復三次。

檢測方法

1. SYBR Green Ⅰ法:
        在PCR反應體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后,發射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。


2. TaqMan探針法:
        探針完整時,報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。


樣品要求
  • 1、須提供新鮮的足量材料(細胞數106個以上,組織100 mg以上),樣品-70℃快遞至本公司(干冰或液氮運送,以保證樣品質量),亦可提供保證質量的DNA或RNA樣品(2 μg以上);
  • 2、提供靶基因信息,包括基因序列或GenBank Accession Number等。
  • 3、提供詳細的背景資料,生物物種信息(Human、Mouse、Rat等)、DNA/RNA來源、基因豐度等。
  • 提供結果

    引物和探針及序列,膠圖,原始數據(包括擴增曲線和熔解曲線)、數據分析結果及實驗報告。


    檢測周期

    常規檢測任務2-3周內完成,具體情況根據要檢測的基因和樣本數而定。

    常見問題

    Q: 如何選擇合適的內參基因?
    A:常見物種做mRNA使用actin做內參,miRNA檢測使用U6做內參,特殊物種根據文獻選擇合適的內參。對于一些無法確定內參的物種,我們可以提供內參基因篩選服務,選出穩定的內參用于后續實驗。
    Q: 引物出現非特異怎么解決?
    A:提高退火溫度;減少引物量;重新設計引物。
    Q: 絕對定量與相對定量有什么區別?
    A:絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數目,即通常所說的拷貝數。相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例,而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數。絕對定量實驗必須使用已知拷貝數的絕對標準品,必須做標準曲線。相對定量可以做標準曲線,也可以不做標準曲線。相對定量實驗有兩種方法:標準曲線法和CT值比較法。如果使用標準曲線法,可以使用絕對標準品,也可以使用相對標準品,而且相對標準品在實驗操作上更為簡便易行。相對標準品是只知道樣品中DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數目的標準品,典型的做法是將一個已知pg數的樣品做一系列梯度稀釋。
    Q: 每個反應管中可以加入多少種探針?
    A:每個反應管中可以加入的探針數目,取決于儀器、軟件、試劑和實驗設計等幾個方面。
            首先是儀器的硬件構成和軟件的解析能力。在軟件解析能力足夠的前提下,全波長檢測的定量PCR儀如激光管-CCD類型對于探針的數量實際上是沒有限制的。如果信號的采集要通過濾色片,那么探針的數量取決于濾色片的數目,增加探針需要增加或改變濾色片。改動儀器的結構通常很困難。以ABI公司的儀器為例,7900和7700是激光-全波長檢測的,7000、7300是4色濾色片的,7500是5色濾色片的。
            其次是化學上的可能性。不同的熒光基團要組合到一起,在同一反應管內使用,必須其激發波長既相對靠近又不能靠得太近,既保證信號激發的效率又保證信號不重疊干擾,能夠區分清楚。現已發現的熒光基團種類有限,滿足這樣條件的分子組合更少。目前的最佳組合只能達到每組4到5種熒光的水平。
            第三是實驗方案的設計和選用的探針類型。定量PCR實驗必須使用ROX校正熒光,占去一種熒光;TaqMan探針的淬滅基團(TAMRA)也要占用一種熒光,對于4色檢測的儀器來說,只剩下2種熒光可以標記探針,對于5色檢測的儀器還有3種熒光可以使用。如果將探針改用TaqMan MGB探針,由于它的淬滅基團是不發熒光的,比之TaqMan探針就可以多1種熒光用于標記探針。如果實驗要求不高,不做ROX校正(AB公司不推薦這樣做),還可以再多一種熒光用于標記探針。
            第四是研究應用本身的要求。如果研究SNP和基因突變,因為絕大多數人類基因是2態的,只存在兩種等位基因,2條探針已經足夠。如果研究基因表達,通常是兩兩比較居多,比如處理比未處理,正常比異常等,加上一個內對照,3色也就足夠了。
            最后是成本控制方面的要求。多重定量的目的一是提高數據精確度,二是節省反應成本。同時測定的基因越多,成本也越低。但是加入4-5種探針,就要同時加入8-10條引物。在引物設計的時候要考慮到盡量減少這些引物之間的競爭和抑制等多種干擾,平衡各對引物之間的PCR效率。雖然這是可以做到的,但是要花費大量時間、人力和物力來篩選最佳引物組合、優化反應條件。如果實驗規模不大,在總體上可能反而不合算。
            在實際應用中,不是單純追求加入的探針越多越好,而是追求總體效益的最優化。比較切合實際的是2到3重反應,引物和探針的設計不太困難,反應條件的優化也不太麻煩,同時降低了成本。
    Q: 什么是雙標準曲線法?
    A:雙標準曲線法是指將內參基因及目的基因分別稀釋5個點,做標準曲線,以確保擴增效率,再根據絕對定量的數據計算差異表達情況。
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