甲基化
        DNA甲基化是最早發現的基因表觀修飾方式之一,真核生物中的甲基化僅發生于胞嘧啶,即在DNA甲基化轉移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶轉變為5’-甲基胞嘧啶。大量研究表明,DNA甲基化能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變,從而控制基因表達。DNA甲基化通常抑制基因表達,去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。這種DNA修飾方在不改變基因序列前提下實現對基因表達的調控。CpG位點在基因組是不常見的,主要密集于接近基因啟動子的位置,統稱為CpG島CpG島大約含有500多個堿基,位于基因的啟動子區或第一個外顯子區。脊椎動物DNA的甲基化狀態與生長發育調控密切相關,比如在腫瘤發生時,抑癌基因CpG島以外的CpG序列非甲基化程度增加,CpG島中的CpG則呈高度甲基化狀態,導致抑癌基因表達的下降。

甲基化特異性的PCR(Methylation-specific PCR,MSP)

        Herman 等( 1996 )在使用重亞硫酸鹽處理的基礎上新建的一種方法。該方法敏感性高,主要用于作定性研究。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA,所有未發生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不變;隨后設計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR。通過電泳檢測MSP擴增產物,如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴增片段,則說明該位點存在甲基化;反之,說明被檢測的位點不存在甲基化。
        特點:適用范圍廣,能夠檢測特異位點是否發生甲基化。

服務訂購

項目類型 檢測方法 DNA甲基化分析服務價格

DNA甲基化服務

BSP-10個克隆

DNA提取和亞硫酸氫鹽處理

片段擴增+10克隆測序

140元/樣品

800元/樣本/片段

MSP-電泳法

詢  價

詢  價


流程

1、樣品用Qiagen試劑盒進行基因組 DNA 提取與重亞硫酸鹽處理(包括純化和脫磺基反應)。
2、用甲基化引物設計相關軟件在甲基化區域設計 甲基化特異性的引物( primer Ⅰ )或非甲基化的引物( primer Ⅱ ) 引物 2 對。
3、 進行特異性的 PCR 擴增,只有結合完全的甲基化或非甲基化特異性引物的片段才能擴增出產物。
4、檢測 MSP 擴增產物,如果用針對處理后甲基化 DNA 鏈的引物能擴增出片段,則說明該被檢測的位點存在甲基化;若用針對處理后的非甲基化 DNA 鏈的引物擴增出片段,則說明被檢測的位點不存在甲基化。

亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)
        亞硫酸氫鹽修飾后測序法( BSP ) Frommer 等( 1992 )提出的研究 DNA 甲基化方法,此方法可靠性及精確度高,能明確目的片段中每一個 CpG 位點的甲基化狀態。
        用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA,所有未發生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設計BSP引物進行PCR,在擴增過程中尿嘧啶全部轉化為胸腺嘧啶,最后對PCR產物進行測序就可以判斷CpG位點是否發生甲基化,稱為BSP-直接測序法。將PCR產物克隆至載體后進行測序,可以提高測序成功率,這種方法稱為BSP-克隆測序法。
        特點:精確度高,能夠準確檢測出甲基化的程度百分比。

流程

1、樣品用Qiagen試劑盒進行基因組 DNA 提取與亞硫酸鹽處理(包括純化和脫磺基反應),使 DNA 中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不變。
2、用甲基化引物設計相關軟件在甲基化區域兩端設計引物。
3、進行基因擴增及 PCR 產物回收。
4、PCR 產物直接測序或克隆測序(定量分析),分析每個 CpG 島甲基化情況 。
5、數據統計分析。與未甲基化的 DNA 樣本進行比對。


樣品要求


1、DNA樣品:濃度≥100ng/ul、體積≥20ul的總DNA樣品,DNA抽提:血液20元/樣本;新鮮組織30元/樣本;石蠟包埋組織50元/樣本;
2、血液樣品:請提供≥500ul抗凝血;采用標準的采樣管, EDTA 抗凝或枸椽酸鈉抗凝;
3、組織樣品:請提供足量的組織樣品(≥300mg);
4、細胞(≥106 );
5、甲基化位點信息:免費提供甲基化島分析。

提供報告

1、MSP:引物序列、實驗報告、包括MSP產物的電泳圖片;
2、BSP:引物序列、測序峰圖、陽性克隆質粒和實驗報告;

甲基化研究思路

尋找甲基化位點
1、甲基化二代測序尋找甲基化位點
對照組和實驗組進行甲基化芯片檢測,找到相關的甲基化位點;
一些相關研究顯示某些基因存在表達量降低的現象,可預測該基因是否存在CpG島;
根據文獻尋找相關基因的甲基化位點。
2、驗證甲基化位點,并進行甲基化程度分析
采用對照組和實驗組樣本進行甲基化驗證;
MSP方法:可進行特定位點甲基化驗證,適用于甲基化芯片后的結果,無法進行甲基化程度分析;
BSP克隆測序法:驗證某些相關基因的甲基化位點,并計算出精確的甲基化程度百分比;
HRM法:適用于大批量樣本甲基化驗證,并能計算出甲基化程度范圍;
焦磷酸測序法:驗證某些相關基因的甲基化位點,并計算出精確的甲基化程度百分比。
3、分析甲基化位點與研究的相關性
根據對照組和實驗組樣本的檢測結果,分析與研究的相關性;
比較對照組和實驗組相同甲基化位點甲基化是否有差異;
比對對照組合實驗組相同基因啟動子區甲基化程度是否有差異。
4、驗證啟動子發生甲基化的基因的表達量變化
采用熒光定量PCR的方法檢測相關基因的表達量,如果表達量降低,可能由于啟動子區發生甲基化導致的,從而影響該基因所在的某些通路,導致一些疾病,或表型發生變化;如果沒有發生變化,可能由于發生甲基化的區域與轉錄因子之間關聯不是很密切,從而不會影響基因的表達。
        DNA甲基化是最早發現的基因表觀修飾方式之一,真核生物中的甲基化僅發生于胞嘧啶,即在DNA甲基化轉移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶轉變為5’-甲基胞嘧啶。大量研究表明,DNA甲基化能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變,從而控制基因表達。DNA甲基化通常抑制基因表達,去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。這種DNA修飾方在不改變基因序列前提下實現對基因表達的調控。CpG位點在基因組是不常見的,主要密集于接近基因啟動子的位置,統稱為CpG島CpG島大約含有500多個堿基,位于基因的啟動子區或第一個外顯子區。脊椎動物DNA的甲基化狀態與生長發育調控密切相關,比如在腫瘤發生時,抑癌基因CpG島以外的CpG序列非甲基化程度增加,CpG島中的CpG則呈高度甲基化狀態,導致抑癌基因表達的下降。



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